4. Can we make antibiotics in plants which we can eaily find?
Ⅲ-2. 프로젝트 연구 활동
1. 주제 선정 배경
프로젝트 연구 활동을 위한 주제를 찾던 중, 고깃집 계산대에 옷에 배인 냄새를 제거하기 위한 탈취제인 ‘페브리즈’가 놓여 있는 것을 보았다. 페브리즈의 주요 기능은 탈취 효과 및 섬유에 서식하는 미생물을 제거하는 항균 효과 등이다. 여기에 착안하여 우리 동아리에서는 천연 식물에서 페브리즈와 같은 기능을 하는 항균 성분을 추출하여 실생활에서 이용할 수 있는 시제품을 만들어 보기로 하였다. 즉, ‘천연 항생물질을 이용한 항균 제품 만들기’를 주제로 선정하여 동아리 프로젝트 연구 활동을 시작하였다.
2. 프로젝트 진행 과정
가. 맡은 역할에 따라 4개조로 나누어 식물 속의 천연 항균 성분에 대하여 조사를 한 뒤에 토론을 통해 실험 재료로 양파껍질, 은행잎, 솔잎을 결정하였다.
나. 양파껍질, 은행잎, 솔잎을 건조시킨 후 가루로 갈아서 속시렛 추출장치로 실험에 쓰일 항균성분을 추출해 내었다.
다. 양파껍질, 은행잎, 솔잎 추출액의 항균 효과를 증명하기 위해 혼합 배지 제작 후, 손에서 채취한 미생물을 접종하여 증식 정도를 비교하였다.
3. 각 조별 활동 내용
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조 |
활동 내용 |
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1조 |
항생제감수성 검사로 자주 사용하는 디스크 확산법을 이용하여 추출한 항생 물질들에 균들이 얼마나 예민한지에 대하여 실험을 진행하였다. 이 실험을 통하여 실제로 제품을 만들 때 넣을 항생물질들이 정확히 어느 정도의 항균성을 가지고 있는지 확인하였다. |
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2조 |
속시렛 추출장치로 추출한 항생물질들을 각각 농도를 다르게 설정하여 배지에 함유시킨 후 각각의 배지마다 같은 균주를 접종시켜서 실제로 항균성을 나타내는지에 대하여 조사하였다. 또 농도를 다르게 함으로써 항균성의 차이를 확인하였다. |
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3조 |
여러 가지 항균 물질을 혼합하여 제품을 만들기 위해 항균 물질을 여러 비율로 혼합하여 배지를 만들었다. 이로써 실제로 혼합했을 때에도 항균 효과를 나타내는지 확인하고, 어떤 비율에서 가장 높은 항균성을 가지는지에 대하여 확인하였다. |
4. 연구 과정
과정1. 은행잎, 솔잎, 양파껍질에서 항생물질 추출하기
가. 실험목표 : 은행잎, 솔잎, 양파껍질에서 항균물질을 추출해 낸다.
나. 실험조 : 동아리 회원 전체
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요일 |
월 |
화 |
수 |
목 |
금 |
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실험자 |
유종우 |
이재은 |
오진 |
원재훈 |
이재욱 |
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이하나 |
김은수 |
황미림 |
한예훈 |
장준한 |
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강가희 |
이채현 |
최선영 |
박준영 |
최지선 |
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조정원 |
김정아 |
서한비 |
주승찬 |
최수영 |
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김동영 |
박영재 |
김동영 |
최가영 |
박영재 |
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오은아 |
정준혁 |
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김은수 |
김동영 |
다. 실험기간 : 2011.6.23. ~ 2011.6.30
라. 실험기구 및 시약 : 건조기, 속시렛 추출장치, 원통여과지, 가열교반기,
항온수조, 마이크로 피펫, 전자저울, 막자사발, 에탄올
마. 실험과정
1) 학교, 가로수 등에서 은행잎과 솔잎을 채취하고, 채소가게에서 양파를 구입한 뒤 껍질만 모은다.
2) 재료들을 깨끗이 씻은 후 건조기를 이용하여 6시간씩 2번 건조시킨다.
3) 건조된 은행잎, 솔잎, 양파껍질을 막자사발에 넣고 가루로 만들고 가루를 다시 한 번 건조시킨다.
4) 은행잎, 솔잎, 양파껍질 가루 20g을 각각 원통여과지에 넣어 준비한다.
5) 속시렛 추출장치의 용매플라스크에 에탄올 150mL를, 원통여과지는 추출관에 넣고 용매플라스크, 추출관, 환류냉각기를 연결시킨다.
6) 용매플라스크를 4시간 동아 물중탕 가열하여 추출한다. 이 때, 물이 쉽게 기화되지 못하도록 수조에 알루미늄 호일을 덮어준다.
7) 추출된 성분이 녹아있는 에탄올을 비커에 담아 에탄올을 모두 기화시킨다.
8) 에탄올이 모두 기화된 비커에 에탄올 5mL를 넣은 뒤 추출액을 만들고 상층액만 취하여 멸균된 튜브에 넣는다.
바. 실험결과 : 은행잎, 솔잎, 양파껍질 추출액을 각각 7mL씩 추출하였다.
과정2. 항생물질이 함유된 배지 제작 및 배양
가. 실험목표 : 액체 배지에서 배양한 균을 LB 고체배지에 평판도말한 후, 디스크 확산법을 이용하여 추출액에 대한 감수성을 알아본다.
나. 실험조 : 1조(김동영, 유종우, 정준혁, 박준영, 최가영, 오은아, 이재은)
다. 실험기간 : 2011.7.25. ~ 2011.8.2
라. 실험기구 및 시약 : 마이크로 피펫, 거름종이, 펀치, 핀셋, 고압멸균기, 전자저울, LB-agar, TSA(Tryptic Soy Agar)
마. 실험과정
1) 거름종이를 펀치를 이용하여 동그랗게 오린다.
2) stock solution을 각각 x1, x25, x50로 희석시킨 working solution을 제작한다.
3) working solution을 적신 거름종이를 평판도말한 배지 위에 옆의 그림과 같이 떨어뜨린다.
4) 항온기에 넣고 약 72시간 정도 배양한다.
5) 배지에 생성된 억제대를 관찰하여 내성균의 추출액에 대한 감수성을 판별한다.
바. 실험결과 및 결과해석
1) 실험결과
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배지종류 항균물질 |
LB |
TSA |
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은행잎 |
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솔잎 |
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양파 |
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control |
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2) 결과해석
솔잎과 은행잎에서 억제대가 발견되었다. 은행잎은 x1배 디스크 한 개에서 억제대가 발견되었고 나머지 디스크에서는 억제대가 발견되지 않았다. 솔잎에서는 x1 디스크 두 개에서 억제대가 발견 되었다. 양파에서는 억제대가 어렴풋이 나타났으나 명확하게 나타나지는 않았다. 이로보아 솔잎이 가장 균에 대해 감수성이 컸고 그 다음으로 은행잎 그리고 양파가 가장 감수성이 작았다.
과정3. 추출한 항생물질로 혼합배지를 만들어 균의 증식정도 비교
가. 실험목표 : 각 항균물질의 항균정도를 비교하고, 어느 농도이상 되어야 항균물질이 효과가 있는지 알아본다.
나. 실험조 : 2조(강가희, 이하나, 오진, 조정원, 황미림, 최지선)
다. 실험기간 : 2011.7.25. ~ 2011.8.2
라. 실험기구 및 시약 : 마이크로 피펫, 삼각플라스크, 고압멸균기, 클린벤치,
petri-dish, LB(Luria-Bertani), TSA(Tryptic Soy Agar)
마. 실험과정
1) 혼합배지 제작
가) LB-Agar / TSA 4g을 삼각 플라스크에 넣는다.
나) 물 50mL를 삼각 플라스크에 넣고 LB-Agar / TSA를 물에 녹인다.
다) LB-Agar / TSA를 녹인 용액을 매스실린더로 옮긴다.
라) 증류수를 더 넣어 100mL를 맞춰 삼각 플라스크에 옮겨 담고 호일로 밀봉한 후, 고압 멸균기에 넣어 15분간 멸균한다.
마) 멸균한 LB-Agar / TSA를 굳지 않도록 교반기에서 식힌다.
바) 배지의 온도가 50℃∼55℃ 정도일 때, 플라스크 속 배지 용액을 petri-dish에 약 15mL 정도로 분주한다.
사) 증류수로 희석한 항생물질(솔잎, 은행잎, 양파껍질)을 2mL씩 배지에 섞어 혼합배지를 제작한다.
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* 배양액 희석 |
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희석배수 |
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원액 |
1,000㎕ |
200㎕ |
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희석액 |
9,000㎕ |
9,800㎕ |
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총액 |
10㎖ |
10㎖ |
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2) 균 배양
가) 제작한 LB고체배지 및 TSA배지에 채취한 균이 묻어있는 면봉을 streaking한다.
나) 파라필름으로 밀봉하여 항온기에서 약 48시간 배양한다.
다) 고체배지에서 배양된 균을 LB 고체 배지에 계대 배양한다.
3) 균 접종
가) 백금이을 사용하여 배양액을 streaking한다.
나) 뚜껑을 덮고 파라필름으로 밀봉한 뒤 뒤집어서 37℃ 항온기에 넣고 배양한다.
다) 72시간 후 항온기에서 꺼내어 생성된 colony의 양을 확인한다.
라) 다)의 결과를 바탕으로 각 배양액에서의 증식 정도를 비교한다.
바. 실험결과 및 결과해석
1) 실험결과
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추출 물질 |
희석 배수 |
배지종류 |
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LB |
TSA |
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은행잎 |
⨯1 |
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⨯10 |
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⨯50 |
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솔잎 |
⨯1 |
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⨯10 |
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⨯50 |
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추출 물질 |
희석 배수 |
배지종류 |
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LB |
TSA |
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양파 껍질 |
⨯1 |
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⨯10 |
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⨯50 |
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2) 결과해석
모든 x1배지에서는 균이 자라지 못했고,x10일 때 TSA배지에서는 모두 균이 자란 반면에 LB배지에서는 솔잎에서만 x10에서 균이 배양되었다. x50에서는 모든 배지에서 균이 배양됨을 확인하였다. 이로보아 대부분의 추출액들은 x1일 때 항균성을 강하게 나타내었지만 x10부터는 항균성이 조금 약해졌다. 또한, 주로 TSA배지에서 LB배지에서 보다 균이 많이 배양된 것으로 보아 혐기성균에 대하여 항균성이 더 떨어진다는 것을 추측할 수 있었다. x50 부터는 거의 모든 균들에 대해 항균성을 가지지 못하였다. 이 실험 결과를 종합해보면 추출액들은 x1 상태에서는 모두 강한 항균성을 가지지만 점점 희석이 될수록 혐기성균에 대하여 먼저 항균성이 줄어들고 다음으로 호기성균에 대하여 항균성이 줄어든다는 것을 알 수 있었다.
과정4. 각 항균 물질을 섞어 혼합 배지 제작 및 균 배양
가. 실험목표 : 항균 물질을 여러 비율로 혼합하여 배지를 만들고, 어떤 비율에서 가장 높은 항균성을 가지는지 확인한다.
나. 실험조 : 3조(김은수, 최수영, 김정아, 서한비, 원재훈, 주승찬)
다. 실험기간 : 2011.7.25. ~ 2011.8.2
라. 실험기구 및 시약 : 마이크로 피펫, 삼각플라스크, 고압멸균기, 클린벤치,
petri-dish, LB(Luria-Bertani), TSA(Tryptic Soy Agar)
마. 실험과정
1) 배지제작(※배지는 LB와 TSA 모두 제작함(이하 LB, TSA 통칭 배지))
가) 비커에 하나의 배지 당 15mL로 계산한 배지 분말의 양을 넣고 그에 맞는 비율의 증류수를 넣는다.
나) 고압 멸균기에 넣어 끓인 후, 클린 벤치에서 식히고 호일로 밀봉한다.
다) 적당히 식은 배지에 희석하지 않은 각 항균 물질비율에 맞추어 넣고 petri-dish에 20mL씩 나누어 부어준다.
2) 접종 및 균 배양
가) 백금이를 사용하여 배양액을 streaking한다.
나) 뚜껑을 덮고 파라필름으로 밀봉한 뒤 뒤집어서 37℃ 항온기에 넣고 배양한다.
다) 72시간 후 항온기에서 꺼내어 생성된 colony의 양을 확인한다.
라) 다)의 결과를 바탕으로 각 배양액에서의 증식 정도를 비교한다.
바. 실험결과 및 결과해석
1) 실험결과
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희석비율 (솔잎:은행잎:양파껍질) |
배지종류 |
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LB |
TSA |
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1 : 1 : 1 |
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희석비율 (솔잎:은행잎:양파껍질) |
배지종류 |
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LB |
TSA |
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|
2 : 1 : 1 |
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|
1 : 2 : 1 |
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|
|
1 : 1 : 2 |
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2) 결과해석
LB배지에서는 모든 비율에서 균이 자랄 수 없었으나, TSA배지에서는 4가지 경우 중 2가지에서 균이 자란 것으로 보아 혐기성균이 호기성균보다 항생물질에 강하다는 것을 알 수 있었다. 또한 솔잎:은행잎:양파껍질을 2:1:1로 섞은 TSA배지에서 균이 자란 것으로 보아 솔잎 추출물질이 다른 2가지 항균물질보다 혐기성 균에 대하여 더 항균효과가 약하다는 것을 알 수 있었다.
