2. How can we make restriction enzyme map in plasmid?

1. 탐구 설정의 이유

 

영재 학급 생물시간에 대장균의 plasmid DNA와 전기영동에 대해서 접하게 되었다. 배양시킨 대장균에 여러 가지 화학 물질을 처리하면 plasmid DNA를 추출할 수 있고, 이 추출된 plasmid의 전기영동을 통해 크기를 알 수 있다. 수업 시간에 배운 내용을 확장시켜 우리 주변에 서식하는 여러 가지 세균과 대장균의 plasmid DNA를 추출하고 전기영동을 통해 DNA크기를 비교해보고 싶었다. 또한 특정 염기서열을 절단하는 제한효소를 이용하여 각 세균들의 제한효소지도 작성하게 되었다.

 

 

 

 

 

2. 이론적 배경

 

2.1. DNA(deoxyribonucleic acid)의 구조

 

DNA는 나선구조를 이루는 뼈대(Backbone chain)와 염기(Nucleobase)로 구성되어 있다. 뼈대는 단당류인 디옥시리보스(Deoxyribose)에 인산기(Phosphate)가 결합되어 긴 사슬과 같은 형태를 띄고 있다. 염기에는 퓨린(purine)과 피리미딘(pyrimidine)의 두 가지 종류가 있으며, 퓨린에는 다시 아데닌(Adenine; A)과 구아닌(Guanine; G)의 두 가지가 존재하고, 피리미딘에는 시토신(cytosine; C), 티민(thymine; T), 우라실(uracil; U)의 세 가지가 존재한다. 이 중 우라실은 DNA에는 존재하지 않으며, RNA에만 존재하는 염기이다. DNA가 이중나선을 이루고 있을 때, 각각의 퓨린은 하나의 피리미딘과 수소 결합을 통해 결합한다. 즉, A와 T, G와 C가 항상 짝을 이루어 존재하게 된다. 이러한 수소 결합은 DNA의 이중 나선구조를 안정하게 만들어 주는 힘이다. 이 때, G와 C의 결합 사이에는 3개의 수소 결합이, A와 T의 결합에는 2개의 수소 결합이 존재하며, 따라서 G와 C사이의 결합이 더 강하다. 이러한 염기쌍끼리의 결합을

DNA의 상보성이라고 부른다. 이러한 상보성은 DNA의

정보 저장, 복제, 전사 등에 기여한다.

 

 

2.2. GEL 전기영동[gel electrophoresis]

 

겔은 콜로이드(colloid) 용액이 굳어진 상태를 말하는 것이다. 전기영동이란 말은 전기적인 힘에 의해 전하를 띤 입자가 이동하는 것을 가리키는 표현이다. 따라서 겔 전기영동은 전류를 흘려주어서 전하를 가진 입자가 겔 내부에서 이동하여 분리되도록 하는 기술이다. DNA나 RNA의 경우 주로 아가로즈(agarose)를 사용한다. 겔에 홈을 만들어 DNA나 RNA, 단백질 등의 분자를 집어넣고 전류를 흘려주면 음전하를 띤 이들 분자들은 전기적인 힘에 의해 겔 안에서 이동하게 된다. 같은 크기를 가진 분자들은 하나의 집단을 형성하여 움직이게 되는데 만약 수조개의 동일한 분자들을 전기영동 하였다면 겔을 염색하였을 때 이것이 하나의 띠 모양으로 나타나는 것을 확인할 수 있다. 작은 분자는 큰 분자에 비해 빠른 속도로 이동하기 때문에 결과적으로 서로 다른 크기의 분자들은 겔 상에서 서로 다른 위치에서 띠 모양을 나타내게 된다. 각각의 띠를 이루고 있는 분자들의 크기는 이미 크기를 알고 있는 분자들을 나란하게 전기영동을 하여 겔 상에 나타난 띠의 상대적인 위치를 비교함으로써 그 크기를 측정할 수 있다.

 

2.3. 제한효소[制限酵素, restriction enzyme]

 

제한효소란 세균바이러스의 증식을 막아주는 효소로 침입한 바이러스의 DNA를 절단하는 효소로 발견되어 바이러스의 증식을 제한(restriction)한다고 하여 이름 붙여졌다. 제한효소는 특정한 염기 배열을 인식하여 그 염기의 배열만을 절단한다. 우리가 사용하는 제한효소는 BamHI, HindIII, EcoRI 이고 각각의 제한효소가 인식하는 염기배열은 <그림1>과 같다. <그림2>는 HindIII로 염기배열을 절단하는 것을 시각화 시킨 것이다.

 

 

 

 

<사진 2> 제한효소가 인식하는 염기배열 <사진 3> HindIII로 염기배열을 절단하는 것

 

 

 

3. 탐구의 방법

 

3.1. 액체배지 만들기

 

(1) 실험 도구 : 정밀저울, 약 수저, 유리막대, 삼각플라스크, 매스실린더

(2) 시약: LB, 증류수

(3) 실험 순서

 

① LB(Luria-Bertani) Broth 25g과 DW(증류수)를 넣어서 500ml를 맞추어 액체배지를 만든다.

 

<사진 4> 삼각플라스크에 담긴 액체배지의 모습

 

② 압력밥솥으로 고압•고온 멸균한다.

<사진 5> 압력밥솥으로 멸균하는 모습

 

 

 

 

 

3.2. 대장균 접종 및 배양

 

(1) 실험 도구 : 마이크로 피펫, 팁, 멸균된tube, 항온기, 클린벤치

(2) 실험 순서 :

 

① 액체배지를 멸균된 tube에 넣는다.

<사진 6> 비커에 담긴 액체배지를 tube에 넣는 모습

 

② 액체배지가 들어있는 tube에 대장균을 접종한다.

<사진 7> 마이크로피펫으로 대장균을 접종하는 모습

 

③ 항온기에 tube를 넣고 배양한다.

<사진 8> 항온기를 배양한 것을 확인하는 모습

 

3.3. 미지의 균 접종 및 배양

 

(1) 실험 도구 : 고체배지, 액체배지, 면봉, 멸균tube, 마이크로 피펫, 팁, petri dish

(2) 실험 순서

 

① 고체배지를 만든다.

 

<사진 9> 고체배지를 petri dish에 옮기는 모습

② 미지의 균을 채취, 접종한다.

<사진 10>면봉으로 고체배지에 미지의 균을 접종하는 모습

 

③ 마이크로 피펫 팁으로 콜로니(colony)를 채취하여 액체배지에 접종한다.

 

<사진 11>팁으로 콜로니(colony)를 채취하는 모습

 

 

3.4. plasmid 추출

 

(1) 실험 도구 : 원심분리기, vortexing기, 멸균된1.5ml tube, 마이크로 피펫, 팁, 비커, 휴지, DNA 추출 column

(2) 시약 : solution I, solution II, solution III, solution IV, solution V

(3) 실험 순서

 

① 1.5ml tube 에 배양된 균을 1.5ml 씩 담아서 원심분리기에 2분가량 Cell Down 시킨다.

<사진 12> Cell Down 후의 모습

 

② Solution I 을 250чl을 첨가하고 밑바닥에 있는 세포와 SolutionI이 잘 섞여지도록 Vortexing 한다.

→ SolutionI은 EDTA를 첨가하여 세포벽의 마그네슘 이온에 작용하여 세포벽을 깨지기 쉬운 상태로 만들어 주되 세포가 깨지지 않게 하기 위해 glucose로 삼투압을 유지시켜준다

<사진 13> SolutionI을 넣고 Vortexing한 후의 모습

 

 

 

 

 

 

③ Solution II 를 250чl을 첨가하고 천천히 4~5회 Inverting한다.

(절대 세게 흔들거나 Vortexing하지 않는다.)

→ SolutionII는 lysis solution으로 SDS에 의해 세포막의 단백질의 고유전하고 변하고 lipid가 제거되어 세포가 깨지게 되며 NaOH로 인하여 Ph가 급격히 상승함에 따라 세균의 염색체DNA는 변성되어 분리되고 plasmid는 일부만 영향을 받은 형태로 존재하게 된다.

<사진 14> SolutionII를 첨가한 모습

 

④ Solution III를 350чl을 첨가한 후 곧바로 4~5회 천천히 Inverting한 후에 20분간 원심분리한다..

→ SolutionIII은 Ph 5.4로 NaOH를 중화시켜 튜브 안의 용액이 Ph 7.0의 중성으로 만들어준다.

<사진 15> SollutionIII을 첨가한 모습

 

⑤ 원심분리 후, 상층액만을 DNA 추출 column에 조심스럽게 옮긴다.

⑥ 원심분리 후, tube에 걸러진 액은 버리고 column을 다시 tube에 꽂는다.

⑦ Solution IV를 700чl을 첨가한 후, 2분간 원심분리하고, tube에 걸러진 액을 버리고 또 2분간 원심분리기에 돌린다.

→ SolutionIV에는 에탄올이 포함되어 있으므로 에탄올을 완전히 제거하기 위해 원심분리를 한다.

 

 

<사진 16> SolutionIV를 첨가한 후 원심분리한 모습

 

⑧ Solution V 를 첨가하고 2분간 원심분리기에 돌린다.

→ tube에 걸러진 액이 바로 Plasmid DNA 이다

<사진 17> plasmid DNA의 모습

 

3.5. 제한효소처리

 

(1) 실험 도구 : 마이크로 피펫, 멸균된tube, 항온수조, 대장균과 미지의 균의 plasmid

(2) 시약 : 완충용액, 제한효소(EcorI, BamHI, HindIII), 증류수

(3) 실험 순서

 

① 멸균된 tube에 증류수, plasmid, 완충용액, 제한효소 순으로 넣는다. 우리가 설정한 양은 다음 표와 같다.

 

용액 Tube	완충용액	Dw	Plasmid	HindIII	BamHI	EcorI	총volume
A(대조군)	10(10X)	85	5				100
B	10(10X)	80	5	5			100
C	20(5X)	70	5			5	100
D	10(10X)	80	5		5		100
E	10(10X)	70	10	5	5		100
F	10(10X)	70	10	5		5	100
G	10(10X)	70	10		5	5	100
H	10(10X)	60	15	5	5	5	100

② 항온기를 37도로 맞춘 뒤 tube들을 1시간 가량 둔다.

→보통 항온수조를 사용하지만 항온수조 대신 항온기를 사용하였다.

 

<사진 18> 제한효소가 든 tube를 넣은 항온기

 

3.6. 전기영동 및 UV조사

 

(1) 실험 도구: UV조사기, 전기영동기구, 아가로스 겔

(2) 시약: loading dye, EtBr

(3) 실험 순서

 

① 제한효소 처리한 tube에 loading dye을 넣는다.

→ loading dye는 아가로스겔의 웰에 DNA를 넣어줄 때 DNA용액을 무겁게 하여 웰안으로 가라앉히는 역할을 한다.

 

<사진 19> loading dye를 넣은 tube의 모습

 

② 아가로스겔을 만들어 전기영동기구에 넣는다.

→ 아가로스겔은 1XTAE에 아가로스를 넣고 전자레인지에 약 2분간 돌린 후 EtBr을 첨가한 뒤 gel tray에 부은 뒤 comb를 장착하고 20분간 실온에 방치하여 만든다.

 

 

 

<사진 20> gel tray에 comb을 장착하는 모습

 

③ 웰에 DNA샘플을 넣어 전기영동을 한다.

 

<사진 21> 전기영동을 시키고 난 뒤의 아가로스겔의 모습

※ 사진에서 위쪽에 보이는 회색부분이 웰이다

 

④ 전기영동한 겔을 UV조사기로 확인한다.

 

<사진 22> 왼쪽에 있는 기계가 UV조사기이고, 오른쪽 컴퓨터

모니터에서 전기영동의 결과가 나오는 모습

 

 

 

 

 

 

4. 탐구결과 및 제언

 

4.1. 탐구결과

4.1.1. 1차 실험결과

1차 실험에서 얻은 결과는 다음 사진들과 같다.

 

<사진 23> 대장균 9개와 미지의 균A 2개를 확인한 사진

<사진 24> 미지의 균A 6개와 미지의 균 B 4개를 확인한 사진

<사진 25> 미지의 균B 5개를 확인한 사진

=> 다음 사진에서 볼 수 있듯이 대장균과 미지의 균A, B모두 DNA가 추출되지 않았다.

 

4.1.2. 2차 실험진행과정

2차 실험은 대장균을 8p의 9번 plasmid 추출지 하였고, 미지의 균은 5p의 3번 액체배 지에 접종까지 하였다.

 

 

 

4.2. 제언

 

4.2.1. 1차 실험에 대한 제언

 

1차 실험에서 우리는 대장균뿐만 아니라 미지의 균A, B모두 plasmid DNA가 확인이 되지 않은 것으로 보아 다음과 같은 문제점들을 생각해 볼 수 있다.

 

① 마이크로 피펫 사용법이나 여러 가지 기구 및 inverting 미숙

② SollutionIII를 수업시간에 했던 것을 재활용한 것이 오염되어있었을 가능성

③ 실험 중에 있어 시간을 정확히 지키지 못한 것에 대한 것

④ 마이크로 피펫의 용량과 맞지 않는 양만큼의 시약을 측정한 점

 

4.2.2. 2차 실험에서의 개선된 점

 

① SollutionI~V를 다시 구매하였다.

② 마이크로 피펫을 더 정확하게 사용하는 법을 배웠다.

③ 시간에 유의하면서 실험을 진행하였다.

④ 마이크로 피펫으로 측정할 수 없는 양을 재기 위하여 전체 volume의 양을 늘리기로 하였다.

 

5. 참고문헌

 

William K. Purves(2007) , 생명 생물의 과학, 교보문고

http://genetic2002.blog.me/20011226825

http://terms.naver.com/item.nhn?dirId=1709&docId=5309

http://cafe.daum.net/bioexampass/5KEP/34?docid=1Ec2d%7C5KEP

|34|20090714160624&srchid=IIM97HW0100

1p DNA내용: http://ko.wikipedia.org/wiki/DNA

2p 전기영동내용: http://100.naver.com/100.nhn?docid=829037