1. Are there super bacteria in school?

1. 연구 동기 및 목표

가. 연구 동기

몇 년 전부터 항생제 내성을 가진 슈퍼 박테리아로 인해 세상이 떠들썩했다. 우리 몸에 침투한 병원균에 대항하기 위해 항생제를 사용해오던 사람들은 항생제에 내성을 가진 슈퍼 박테리아의 등장으로 불안에 떨 수 밖에 없다.

우리는 요즘 TV와 인터넷에서 쏟아지는 이런 슈퍼 박테리아에 대한 보도를 보고, 혹시 우리 주변에도 항생제에 내성을 가진 박테리아가 있을까라는 의문이 들어 본 연구를 계획하게 되었다. 물론 우리 주변에서 검출되는 박테리아는 TV나 신문 기사에 나오는 것처럼 인체에 치명적인 박테리아는 아닐 것이다. 하지만 우리는 이 연구를 통해서 우리 주변의 어떤 환경이 박테리아에 많이 노출되어 있으며, 그 중 항생제에 내성을 가진 박테리아는 어느 곳에 있는지를 알 수 있을 것이다.

 

나. 연구 목표

이와 같은 연구 동기에 따라 다음과 같이 3가지 연구목표를 설정하였다.

첫째, 항생제를 첨가한 배지와 일반 배지에 각각 균이 많을 것으로 추측되는 풍덕고등학교의 5개의 장소에서 채취한 균을 접종하고 같은 시간동안 배양한 후 균의 증식여부를 확인하여 항생제에 내성을 가진 박테리아를 발견한다.

둘째, 그람 염색을 이용하여 풍덕고등학교에 서식하는 항생제 내성균의 형태학적 특성을 관찰한다.

셋째, 평판 디스크 확산법을 이용하여 내성균의 항생제 감수성을 측정한다.

 

2. 이론적 배경

가. 항생제

1) 항생제의 정의

다른 미생물이나 생물 세포를 선택적으로 억제하거나 죽이는 항생물질로 된 약재를 말한다. 항생제는 곰팡이 페니실리움에서 만들어진 페니실린에서 시작되었는데, 이런 페니실린 덕분에 40년간 의료혁명이라 할 만큼 여러 세균성 질환을 단순히 치료하는 것을 넘어 박멸시키는데도 크게 기여했다.

 

2) 항생제의 작용 원리

가) 세포벽을 허물어 세균을 죽이는 방식

페니실린과 세펨 계열의 항생제가 여기에 해당된다. 세포벽을 파괴하게 되면 압력 차로 인해 세포는 한꺼번에 사멸된다. 이런 방식의 항생제는 살균력이 매우 강하다.

나) 세포 내부 단백질 합성을 저해, 증식을 박는 방식

세포가 새롭게 합성하는 단백질을 원래 갖고 있던 유전정보와 다르게 만드는 방식으로 마이크로라이드 계열과 아미노글리코사드 계열의 항생제 등이 여기에 해당한다. 세균은 살아가는 데 필요한 성질과는 전혀 다른 단백질이 만들어지면 더 이상 살아갈 수 없게 된다. 이러한 방식의 항생제들은 살균력이 그리 강하지는 않지만 정균성(균의 증식을 정지시키는 효과)이 있다.

다) 유전정보의 복제를 방해하여 세균을 죽이는 방식

세균은 유전정보를 펼쳐서 복제하는데, 이를 위해서는 특정한 효소가 반드시 필요하다. 이 방식은 이런 효소의 움직임을 멈추게 해 세균의 유전정보 복제를 불가능하게 만듦으로서 세균의 증식을 억제한다. 퀴놀론 계열의 항생제가 여기에 해당한다.

 

3) 항생제의 분류

가) 발견 시대와 항균 범위에 따른 분류

(1) 1세대 항생제: 가장 초기에 발견된 항생제로써 항생제의 항균범위가 가장 적고 산에 불안정하다. 주로 그람 양성균에 많이 쓰인다.

(2) 2세대 항생제: 1세대 항생제의 산에 대한 불안정성을 개선하고 항균범위도 그람 양성,음성으로 확대되었다. 1세대보다는 나중에 발견되었다.

(3) 3세대 항생제: 1,2세대 항생제가 치료하지 못하는 녹농균이나 다른 그람 음성균까지도 치료할 수 있는 정도로 항균범위가 확대되었다. 가장 최근에 발견된 항생제이다.

(4) 4세대 항생제: 그람양성균에 대한 효과는 1세대와 같은 정도이지만, 베타락타마제에 대해 3세대 보다 저항성이 뛰어나다. 혈액뇌장벽을 잘 통과하기 때문에 뇌에 있는 균에도 작용하며, 녹농균에도 효과가 있다.

나) 작용 원리에 따른 분류

(1) 페니실린 계열

플레밍이 발견한 페니실린 종류를 말한다. 페니실린G, 암피실린, 아목시실린, 피페라실린 등의 약이 여기에 해당한다. MRSA(메티실린 내린 황색포도알균)라는 말 속에 들어 있는 메티실린도 페니실린 계열의 항생제이지만 부작용이 있다.

페니실린 계열은 세균의 세포벽에 상처를 내는 약으로 강한 살균력을 가진다. 부작용은 비교적 적지만 간혹 페니실린 쇼크라는 알레르기 증상을 일으키는 경우가 있기 때문에 사용하기 전에 피부반응을 보고 알레르기 증상이 있는지 확인하고 쓰고 있다. 페니실린 계열의 약이 듣는 세균에는 포도알균, 사슬알균, 페렴알균 등이다. 인두염, 편도염, 중잉염, 사슬알균감염 등에 약효가 있다.

(2) 세펨 계열

페니실린 계열과 마찬가지로 세포벽에 상처를 내 죽이는 방식이다. 세파크로르, 세파렉신, 세프지닐, 세파졸린, 세포티암 등이 여기에 포함된다. 종류도 많아서 개발된 시기와 종류에 따라 제1세대, 제2세대, 제3세대까지 나눠져 있는데, 너무 많이 사용되고 있어서 새로운 약이 출시된 지 얼마 되지도 않아서 내성균이 생기게 된다. 특히 제3세대 세펨 계열인 세포탁심 등의 약들이 더욱 그래서 현재 제3세대 세펨 계열 항생제 허용은 제한되고 있다. 여러 세균감염의 치료에 효과가 있지만 특히 인두염, 편두염, 기관지염, 폐렴 등에 사용된다.

(3) 마크로라이드 계열

세균의 증식을 억제하는 항생제로 클라리스마이신, 아지스로마이신, 에리스로마이신, 조사마이신 등이 해당된다. 대부분 내복약으로 호흡기의 감염에 사용된다. 이 약의 특징 중 하나는 세포벽이 업서나 세포 내에서 기생하는 마이코플라즈마와 클라미디아에도 작용한다는 것이다. 편도염, 인두염, 기관지염, 백일해, 마이코플라즈마폐렴 등에 처방된다.

(4) 테트라사이클린 계열

테트라사이클린 계열은 네성균 급증의 위험과 6세 미만의 아이가 복용할 떄 치아가 누렇게 변하는 부작용으로 현재는 잘 사용되고 있지 않다. 하지만 성병의 일종인 크라미디아 등에는 여전히 사용되고 있다.

(5) 퀴놀론 계열

순수 화학물질로 구성되어 세균이 분열할 때 필요한 DNA의 복제를 돕는 효소를 방해하는 식으로 세균을 퇴치한다. 오플로사신, 노르플로사신, 레보플로사신 등이 있다.

 

나. 항생제내성균

항생제를 지속적으로 사용하게 되면 내성을 획득하는 균이 생겨나게 된다. 스스로 세포벽을 두껍게 해서 항생제의 공격을 방어하거나 특수한 효소를 생산, 약효를 없애는 균들이 돌연변이로 탄생하는 것이다. 세균은 자신의 돌연변이로 내성을 만들 뿐 아니라 각자가 가진 내성을 교환해 더욱 강력한 내성균을 만들기도 한다. 세포 안의 작은 링 모양으로 생긴 플라즈미드라는 내부기관은 세포내의 독립적으로 존재하는 DNA를 구성하는 핵인데, 이를 통해 내성을 교환하게 된다. 우리가 흔히 ‘슈퍼박테리아’라고 부르는 다제내성균은 여러 종류의 항생제에 내성을 지니게 된 박테리아로서, 대표적으로 1996년 일본에서 발견된 VRSA(Vancomycin Resistance Staphyllococus Aureus)가 있다.

식품의약품안전청이 발행하는 <식품의약품통계연보>(2002)에 따르면 우리나라의 항생제 시장규모는 전체 의약 시장 7조 755억 원의 14.5%인 1조 246억 원에 달하는 수준이다. 이는 우리나라의 항생제 의존성이 높다는 말을 반증한다. 2002년 식품의약품안전청의 <항생제 내성발생요인에 관한 상관성 연구>에 의하면 우리나라 국민의 페니실린 내성률은 79.7%로 미국보다 10% 이상 높으며 영국 15%, 캐나다 6~10%에 비해 매우 높으며, 아시아 10개국 가운데서도 가장 높고 국내 3차 병원에서 검출되는 황색포도알균의 70% 이상이 메티실린 내성균이며 1,2차 병원도 황색포도알균의 메티실린 내성률이 43%에 이른다고 한다. 또한 2003년 식품의약품 안전청의 <일반인 대상 항생제 내성 모니터링>보고서에 따르면 2003년 서울의 일반인 3096명의 코에서 분리한 황색포도알균 781균주의 내성 현황을 측정한 결과, 페니실린의 내성은 91.8%, 에스트로마이신 내성은 14.2%, 겐타마이신 내성은 9.3%, 테트라사이클린 내성은 8.2% 등으로 나타났다.

 

다. 배양 배지

미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위하여 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 하고, 다시 특수한 목적을 위한 물질을 넣어 혼합한 것이다.

생물은 생존 ·발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질로서 다량요소, 미량요소 등을 요구한다. 그 중 기체상으로 얻어지는 것을 제외하고는 모두 무기 또는 유기화합물로서 배지에 공급해 주어야 하는데, 필요한 화합물은 독립영양 ·종속영양 등 영양 형식에 따라 여러 가지이다. 보통 영양원은 탄소원 ·질소원 ·무기염류 ·발육인자(비타민류) 등으로 나누어서 생각한다. 특히 발육인자와 관련하여 생물체에서 추출한 비교적 복잡한 조성을 가진 것을 주체로 한 경우를 천연배지라고 한다.

세균배양에는 육즙 ·혈청 등이, 곰팡이배양에는 맥아추출물 등이 흔히 사용된다. 이에 대하여 무기염류만 또는 구조가 확실한 탄소원 ·질소원을 가한 조성이 명확한 경우를 합성배지라고 한다. 대량 배양에는 액체배지가 적당하고, 주(株)의 보존이나 분리에는 한천, 젤라틴 등을 가한 고형배지를 사용한다. 많은 종류의 세균을 포함하는 재료로부터 목적균을 추출하기 위한 배지를 선택배지라고 한다. 배지는 완전히 멸균한 후에 목적균을 심지 않으면 잡균이 증식될 염려가 있고, 배지를 보존하기 위해서도 반드시 멸균이 필요하다.

1) 배양 배지의 종류

가) LB배지(LB Agar)

LB배지는 Luria-Bertani media에서 앞 글자만 따서 LB배지 라고 한다.

미생물을 키울때 가장 일반적으로 쓰는 배지라고 할 수 있다.

조성은 tryptone 10 g/liter, NaCl 10 g/liter, yeast extract 5 g/liter로 들어간다.

위의 세가지를 증류수에 넣고 녹이면 LB배지가 완성된다. LB-agar 배지, 고체 LB배지를 만들 때는 LB배지의 조성을 그대로 따라가되 agar를 처가하여 굳히면 된다. LB 배지에 들어가 있는 NaCl은 배지의 삼투압을 맞춰서 세균들이 터지지 않게 한다.

나) TSA배지(Tryptic soy agar)

Tryptic soy agar (상품명; Trypticase soy agar; BBL)는 미생물 배양과 분리 목적으로 사용하는 배지로서 혈액을 첨가하면 균종의 용혈성을 알 수 있다. 그러므로 혈액한천평판배지는 영양강화배지이면서 용혈성을 구분하는 감별배지이다. Streptococcus pyogenes의 용혈을 찾기 위해 이 배지를 사용할 때는 배지를 백금이 등으로 배지 바닥까지 여러 번 천자한 후 배양한다. 천자된 부위는 산소압이 낮아져 산소에 불안정한 hemolysin O의 용혈을 증가시킨다. S. pyogenes의 선별을 위해서 혐기성 배양을 시행할 수 있다.

3. 연구 과제

가. 연구샘플의 선정

일반적으로 세균은 습하고 햇빛이 잘 들지 않는 곳에서 성장속도가 빠르다. 따라서 우리는 학교의 여러 곳 중 습하고 햇빛이 잘 들지 않는 5곳을 선정하여 균을 채취하였다.

 

[그림 1] 공사장		[그림 2] 화장실세면대
	먼지가 많고 건조하다.		습하고, 지저분하다.
[그림 3] 운동장개수대		[그림 4] 분리수거장
	오래 쓰지않아서 건조하며, 먼지가 많다.		지저분하며, 건조하다.
[그림 5] 에어컨
	매우건조하며 먼지가 많다.

위와 같이 선정된 연구 샘플을 이용하여 항생제를 첨가한 배지와 일반 배지에 교내의 5개 장소에서 채취한 균을 접종하고 배양한 후, 균의 증식 여부를 확인하는 연구와 그람염색을 이용하여 풍덕고에 서식하는 항생제 내성균의 형태학적 특성을 관찰했다. 또한 내성균의 항생제 감수성을 평판 디스크 확산법을 이용하여 측정하였다.

[연구 과제 1] : 풍덕고에 서식하는 항생제 내성균 찾기

[연구 과제 2] : 그람염색을 통한 항생제 내성균의 형태학적 특성 파악

[연구 과제 3] : 평판 디스크 확산법을 이용한 항생제 감수성 측정 으로 구분하였다.

나. 연구 방법

1) 연구 일정

 

기간	연구 내용	세부 내용	비고
10.23	연구 내용 계획 및 자료 수집	이론적 배경 및 실험 방법 숙지
	연구에 필요한 실험기구 정리	항생제 주문(테트라사이클린)
10.24	샘플 채취를 위한 장소 선정	총 9개의 장소 선정
	샘플 채취	면봉을 이용하여 채취 후 지퍼백에 담는다
10.25-26	1차 실험 시작-배지 제작 및 접종	LB 배지 10개 제작
		항생제 배지 20개 제작 (테트라사이클린, 스트렙토마이신)	(항온기에 48시간 배양)
10.27	항생제 내성균 판별	항생제 배지에서 살아남은 배지 6개를 분류
	배지 제작	확인 실험에 필요한 LB 배지 제작
10.28-29	확인 실험	항생제에 내성이 있을 것으로 추정된 균을 접종한 후 디스크 확산법을 이용해 내성 확인	(disc dispenser가 없어 거름종이를 이용)
10.30	확인실험의 결과 분석
11.24	2차 실험 계획	균을 채취하는 장소를 5장소로 축소함
		연구과정에 그람염색과 항생제 감수성 검사를 추가함
3.27 -4.4	실험에 필요한 배지 제작, 균 접종	stock solution(테트라사이클린 50ml, 클로람페니콜 50ml, 암피실린 5ml)
		LB-agar 배지 제작(항생제당 각각 6개씩 포함, 총 24개 제작)
		TSA 배지 제작(항생제당 각각 6개씩 포함, 총 24개 제작)
		액체 배지 250ml 제작
4.5 -4.7	내성균 판별	접종한 항생제 배지에서 내성균 확인
		액체배지에 접종
4.6	그람염색을 이용해 균 판별	내성균이 발견된 11개의 배지에서 각각 그람염색을 실시
4.9 -4.12	디스크 판별	액체 배지에서 배양한 내성균을 LB배지에 평판 도말
		항생제를 희석시켜 각각 500배, 1000배, 1500배, 2000배(클로람페니콜은 1700배) 희석액을 제작
		평판도말한 배지에 항생제 희석액을 묻힌 거름종이를 놓음

2) 실험 기기 및 시료

가) 실험 기기

(1) 교반기

액체와 액체, 액체와 고체, 또는 분체 등을 휘저어 섞는 기구이다. 주로 배지를 제작할 때 사용하였는데, 삼각플라스크 안에 마그네틱 바를 넣은 후 교반기 위에 올려놓고 전원을 켜면 마그네틱 바가 회전하면서 배지를 섞는다.

(2) 마이크로피펫

일정한 부피의 액체를 측정하는 기구를 피펫이라고 하는데, 실험에 사용된 마이크로 피펫은 μl 단위의 정밀한 양을 측정할 수 있다. 본 연구에서는 항생제 stock solution을 제작하거나 희석시킬 때 이용하였다.

(3) 알코올램프

미생물 실험을 할때는 배지의 오염을 막기 위하여 클린벤치를 사용한다. 그러나 우리 학교의 사정상 클린벤치를 사용할 수 없어서 대체 수단으로 알콜램프를 이용하였다. 불을 붙인 알코올램프는 멸균 효과가 있어, 반경 30cm이내의 공간에서 작업을 하면 배지가 오염되지 않는다.

(4) 피펫에이드

마이크로피펫보다 많은 양(1~10ml)을 측정하고자 할때 사용한다. 피펫에이드는 빨아들이는 버튼과 내보내는 버튼이 손잡이 부분에 있어, 자동으로 액체를 취할 수 있다. 배지를 제작할때와 항생제를 희석시킬때 사용하였다.

(5) 고압 멸균기

 

[그림 6] 교반기	[그림 7] 알코올램프
[그림 8] 피펫에이드	[그림 9] 고압 멸균기

배지를 제작할 때 배지 안에 잔류하는 미생물을 제거하기 위해서 고압 멸균기를 이용하였다. 121℃에서 15분을 고압 증기 멸균하였다.

 

나) 실험 시료-항생제

(1) 클로람페니콜 (chloramphenicol)

방선균 Streptomyces venezuelae, S. omiyaensis 등에 의해 얻은 항생물질. 화학합성으로도제조하고 있다. 그람양성균, 음성균, 리케차, 크리미디아에 정균적으로 작용한다. 1947년에 에를리히가 정균적으항생물질로 장티푸스에 특효가 있다. 재생불량성 빈혈 등에는 부작용이 있어 임상적으로 사용을 제한하고 있다. 세균의 리보솜의 50S 소단위(L16 단백질)에 작용하고 펩티드전이작용을 저해한다. 내성은 세균의 아세틸전달효소의 생산에 의해 나타난다. 3-OH기가 아세틸화되고 이것이1-OH기에 전위되고 새롭게 생성된3-OH도 아세틸화된다.

 

[그림 10] 클로람페니콜

 

 

(2) 암피실린(Ampicillin)

최초로 개발된 항생제 중의 하나인 반합성 페니실린. 6-아미노페니실린산에 산(酸)기를 붙여서 만든다. 암피실린은 가장 널리 사용되는 천연 페니실린인 페니실린 G와 비슷한 작용을 하며, 위산에 더 안정하여 경구투여가 가능하다. 암피실린은 또한 특정 세균주에 대해 활성이 더 강하다. 암피실린은 투여하기가 쉽기 때문에 널리 쓰이는 페니실린 항생제이다.

암피실린은 그람음성세균세포 표층의 투과성이 뛰어나고, 그람양성균뿐만 아니라, 대부분 의 그람음성균에도 유효한 넓은 항균스펙트럼을 가진 광역페니실린의 대표적인 경구약제이다. 녹농균, Klebsiella에는 항균성이 낮다. 또 β-락타마아제 감수성이고, 동(同)효소생산균에도 항균성이 낮다.

 

 

[그림 11] 암피실린

 

(3) 테트라사이클린(tetracycline)

Streptomycine aureofaciens 또는 다른 Streptomycines에 의해 생산되는 테트라사이클린계 항생물질이다. 광범위한 항균작용을 나타내며, 여러 종류의 세균, 리케치아, 대형 바이러myc유효하며다. 에 널리 이용된다. 테트라사이클린의 주요 작용클린의 주요류의 세균3 리치아,와 결합하면, 아미노아실tRNA의 A사이트와의 결합을 저해하여 단백질합성을 억제한다.

약전명은 염산테트라사이클린이고, 상품명은 아크로마이신이다. 일반적으로 여드름을 치료하는 데에 사용되고 있다.

 

 

[그림 12] 테트라사이클린

 

3) [연구 과제 1] : 풍덕고에 서식하는 항생제내성균 찾기

가) 일반 배지 만들기

(1) LB 배지

① LB-Agar 분말 20g을 저울로 잰 후 삼각 플라스크에 넣는다.

② 증류수 적당량을 삼각플라스크에 넣고 LB-Agar을 교반기를 이용하여 물에 녹인다.

③ LB-Agar를 녹인 용액을 메스 실린더에 옮긴 후, 증류수를 첨가하여 500ml 눈금에 맞춘다.

④ 121℃에서 15분 동안 고압증기멸균을 한다.

⑤ 멸균한 삼각 플라스크가 오염이 되지 않도록 알콜램프를 켜놓은 곳에서 식힌다.

⑥ 배지의 온도가 50℃～55℃정도 일때, 플라스크 속 배지 용액을 petri-dish에 약 15ml정도로 분주한다.

⑦ 배지가 완전히 굳었을 때, petri-dish의 뚜껑을 닫는다.

(2) TSA 배지

① TSA분말 20g을 저울로 잰 후 삼각 플라스크에 넣는다.

② 증류수 적당량을 삼각플라스크에 넣고 TSA를 교반기를 이용하여 물에 녹인다.

③ TSA를 녹인 용액을 메스 실린더에 옮긴 후, 증류수를 첨가하여 500ml 눈금에 맞춘다.

④ 121℃에서 15분 동안 고압증기멸균을 한다.

⑤ 멸균한 삼각 플라스크가 오염이 되지 않도록 알콜램프를 켜놓은 곳에서 식힌다.

⑥ 배지의 온도가 50℃～55℃정도 일때, 플라스크 속 배지 용액을 petri-dish에 약 15ml정도로 분주한다.

⑦ 배지가 완전히 굳었을 때, petri-dish의 뚜껑을 닫는다.

 

[그림 13] 분말 20g을 저울에 잰다.	[그림 14] 교반기로 LB-agar를 녹인다.
[그림 15] 고압멸균기에 멸균한다.	[그림 16] 알콜램프로 오염을 방지한다.
[그림 17] petri-dish에 배지를 분주.	[그림 18] 굳은 plate의 뚜껑을 닫는다.
[그림 19] 고압 증기 멸균	[그림 20] 배지 제작

나) 항생제 배지

항생제 배지는 LB 배지와 TSA 배지에 항생제 stock solution을 넣어서 만든다.

stock solution 제작 방법 및 배지의 첨가하는 양은 다음 표와 같다.

 

분류		암피실린	테트라사이클린	클로람페니콜
stock solution	용매(㎖)	물 1㎖ 당	에탄올 50㎖	에탄올 10㎖
	항생제(mg)	50	250	3400
배지	배지의 양(㎖)	100	100	100
	stock solution의 양(㎕)	100	50	60
	희석배수	×1000	×2000	×1700

 

[그림 21] stock solution 제작	[그림 22] 항생제 희석시키기

※ 제작한 배지의 종류

 

	대조군	운동장 개수대	화장실 세면대	공사장	분리 수거장	에어컨
LB 일반	○	○	○	○	○	○
LB 항생제	○	○	○	○	○	○
TSA 일반	○	○	○	○	○	○
TSA 항생제	○	○	○	○	○	○

다) 채취한 균의 접종

① 제작한 LB 배지 및 TSA 배지에 채취한 균이 묻어있는 면봉을 streaking한다.

② 파라필름으로 밀봉하여 항온기에 약 48시간 가량 배양한다.

 

 

[그림 23] streaking	[그림 24] 파라필름으로 밀봉

4) [연구 과제2]:그람염색을 통한 항생제 내성균의 형태학적 특성 파악

가) 그람염색

① 슬라이드에 균을 도말하여 건조 시킨다.

② 건조된 슬라이드에 Crystal Violet 용액을 충분히 떨어뜨려 1분간 염색한 후 물로 세척한다.

③ Iodine 용액을 슬라이드에 떨어뜨려 1분간 염색한 후 세척한다.

④ Acetone Alcohol로 15초간 탈색한 후에 세척한다.

⑤ Safranin 용액으로 45초간 대조 염색한 후 세척한다.

⑥ 슬라이드 뒷면을 닦아 깨끗하게 하고 세워 건조한다.

⑦ 현미경을 사용해서 관찰한다.

 

[그림 25] 균을 도말하여 건조	[그림 26] Crystal Violet 염색
[그림 27] Iodine 염색	[그림 28] Acetone Alcohol로 탈색

5) [연구 과제 3] : 평판 디스크 확산법을 이용한 항생제 감수성 측정

 

가) 액체 배지에 배양

배지에 평판도말하기 위해서 고체배지에 있는 콜로니를 채취하여 액체배지에 배양한다.

① LB-broth 15g을 저울로 잰다.

② 비커, 또는 삼각 플라스크에 분말을 넣고 증류수 200ml정도를 넣어 분말을 녹인다.

③ 분말이 충분이 녹으면, 메스 실린더를 이용하여 증류수를 500ml정도로 맞춘다.

④ pH를 7에 맞춘다.

⑤ 121℃에서 15분 동안 고압증기멸균을 한다.

⑥ 멸균된 배지를 교반기로 저어주어 40～50℃까지 식힌다.

⑦ 마이크로피펫의 tip을 이용해서 고체배지에 있던 콜로니를 채취한다.

⑧ 액체배지에 tip체로 투여 한 후 밀봉하여 항온기에 배양한다.

 

[그림 29] LB-broth 15g을 저울로 잰다.	[그림 30] 분말을 증류수에 녹인다.
[그림 31] 고압멸균기로 멸균한다.	[그림 32] 교반기로 돌리면서 식힌다.

나) 평판 도말과 디스크법

액체배지에서 배양한 균을 LB 고체배지에 평판도말한 후, 디스크 평판법을 이용하여 항생제에 대한 감수성을 알아본다. 시중에서 파는 항생제 disc를 구입하지 않고, 거름종이에 제조한 항생제 stock solution을 묻혀 disc를 대체하였다.

① 거름종이를 펀치를 이용하여 동그랗게 오린다.

② 항생제를 희석시켜 stock solution을 제작한다.

③ 액체배지 100㎕당 증류수 1㎖를 첨가한 용액 100㎕를 LB-agar 배지에 평판 도말한다.

④ stock solution을 각각 500배, 1000배, 1500배, 1700배(테트라사이클린은 2000배)로 희석시킨 working solution을 제작한다.

⑤ stock solution을 적신 거름종이를 평판도말한 배지 위에 일정 간격으로 떨어뜨린다.

⑥ 항온기에 넣고 약 72시간 정도 배양한다.

⑦ 배지에 생성된 억제대를 관찰하여 내성균의 항생제에 대한 감수성을 판별한다.

 

[그림 33] LB 배지에 평판도말하기	[그림 34] stock solution을 희석
[그림 35] 배지에 거름종이 붙이기	[그림 36] 거름종이를 희석 배율로 나열
[그림 37] 거름종이에 항생제 묻히기	[그림 38] parafilm을 이용하여 밀봉

4. 결론 및 제언

가. 실험 결과

1) [연구 과제 1]의 실험 결과

총 11개의 항생제 혼합 배지에서 내성균이 확인되었다. 결과는 다음의 표와 같다.

가) TSA 배지

 

	Tetracycline	Ampicillin	Chloramphenicol
C o n t r o l
	내성균X	내성균X	내성균X
운동장개수대
	내성균O	내성균X	내성균O
화장실세면대
	내성균O	내성균X	내성균X
공사장
	내성균O	내성균X	내성균X
분리수거장
	내성균O	내성균X	내성균O
에어컨
	내성균O	내성균X(균사)	내성균O

나) LB배지

 

	Tetracycline	Ampicillin	Chloramphenicol
C o n t r o l
	내성균X	내성균X	내성균X
운동장개수대
	내성균O	내성균X	내성균O
화장실세면대
	내성균X	내성균X	내성균O
공사장
	내성균X	내성균X	내성균X
분리수거장
	내성균X	내성균X	내성균X
에어컨
	내성균O	내성균X	내성균X

2) [연구 과제2]의 결과

 

가) LB 배지

 

채취 장소	광학현미경 사진	염색 및 특성
화장실세면대 (LB/Tetracycline)		● 붉은색 ● 둥근모양의 균
화장실세면대 (LB/Chloramphenicol)		● 보라색 ● 둥근모양의 균
화장실세면대 (LB/Ampicillin)		● 보라색 ● 막대모양의 균
운동장개수대 (LB/Tetracycline)		● 보라색 ● 막대모양의 균
운동장개수대 (LB/Chloramphenicol)		● 보라색 ● 둥근 모양의 균이 쌍을 이룸

나) TSA 배지

 

채취장소	광학현미경 사진	염색 및 특성
화장실세면대 (TSA/Tetracycline)		● 붉은색 ● 둥근모양의 균
공사장 (TSA/Tetracycline)		● 보라색 ● 모양이 일정치 않음 ● 나뭇가지 모양을 함
운동장개수대 (TSA/Tetracycline)		● 보라색 ● 막대모양의 균
운동장개수대 (TSA/Chloramphenicol)		● 보라색 ● 막대모양의 균
에어컨 (TSA/Chloramphenicol)		● 붉은색 ● 모양이 일정치 않음 ● 털같은 모양을 함
분리수거장 (TSA/Chloramphenicol)		● 보라색 ● 모양이 일정치 않음 ● 나뭇가지 모양을 함

 

3) [연구 과제3]의 결과

 

 

 

 

	클로람페니콜 (Chloramphenicol)	테트라사이클린 (Tetracycline)
운동장 개수대
화장실 세면대

실험을 실행한 4개의 배지 모두에서 억제대가 생성되었으며, 그 대략적인 크기는 다음 표와 같다.

 

 

 

 

 

가) 클로람페니콜에 대한 감수성

 

희석	운동장 개수대		화장실 세면대
	클로람페니콜 배지	테트라사이클린 배지	클로람페니콜 배지	테트라사이클린 배지
X500
	억제대X	11.5mm	억제대X	14mm
X1000
	억제대X	10mm	억제대X	8.5mm
X1500
	억제대X	7.5mm	억제대X	11mm
X1700
	억제대X	억제대X	억제대X	억제대X

 

나) 테트라사이클린에 대한 감수성

희석	운동장 개수대		화장실 세면대
	클로람페니콜 배지	테트라사이클린 배지	클로람페니콜 베지	테트라사이클린 배지
X500
	13.5mm	8.5mm	18.5mm	억제대X
X1000
	12.5mm	억제대X	11.5mm	억제대X
X1500
	13.5mm	억제대X	억제대X	억제대X
X2000
	억제대X	억제대X	억제대X	억제대X

 

 

나. 결론

1) [연구과제1] : 균이 발견된 배지는 총 11개였으며, 발견된 배지의 항생제는 다음 표와 같다.

 

테트라사이클린 (Tetracycline)	클로람페니콜 (Chloramphenicol)	암피실린(Ampicillin)
LB 화장실 세면대	LB 화장실 세면대	LB 화장실세면대
LB 운동장 개수대	LB 운동장 개수대
TSA 화장실 세면대	TSA 화장실 세면대
TSA 운동장 개수대	TSA 운동장 개수대
	TSA 에어컨
	TSA 분리수거장

암피실린(Ampicillin)에 내성을 가진 균이 발견된 배지는 화장실세면대 한 개로 발견된 수가 가장 작았으며, 테트라사이클린(Tetracycline)과 클로람페니콜(Chloram- phenicol)에 내성을 가진 균이 발견된 배지는 각각 4개와 6개가 있었다. 이는 암피실린보다 테트라사이클린과 클로람페니콜의 사용빈도가 더 높아, 내성균이 존재할 확률이 더 높기 때문이라고 보았다.

2) [연구과제2] : 그람염색을 통하여 [연구과제1]에서 발견한 항생제내성균을 그람 양성균과 그람 음성균으로 나눌 수 있었다.

 

채취 장소 (배지/배지에 혼합된 항생제)	형태학적특성
화장실세면대 (LB/Tr)	그람음성(붉은색으로 염색됨)/구균
화장실세면대 (LB/Cm)	그람양성(보라색으로 염색됨)/구균
화장실세면대 (LB/Amp)	그람양성(보라색으로 염색됨)/간균
운동장개수대 (LB/Tr)	그람양성(보라색으로 염색됨)/간균
운동장개수대 (LB/Cm)	그람양성(보라색으로 염색됨)/쌍구균
화장실세면대 (TSA/Tr)	그람음성(붉은색으로 염색됨)/구균
공사장 (TSA/Tr)	그람양성(보라색으로 염색됨)/모양이 일정치 않음
운동장개수대 (TSA/Tr)	그람양성(보라색으로 염색됨)/간균
운동장개수대 (TSA/Cm)	그람양성(보라색으로 염색됨)/간균
에어컨 (TSA/Cm)	그람음성(붉은색으로 염색됨)/모양이 일정치 않음
분리수거장 (TSA/Cm)	그람양성(보라색으로 염색됨)/모양이 일정치 않음

3) [연구과제3] : 테트라사이클린 배지에서 발견된 균들은 실험결과 테트라사이클린에는 내성이 강하게 나타났지만 클로람페니콜에는 비교적 항생제 감수성이 높았다. 하지만 두 장소 모두 클로람페니콜에 내성을 가졌던 균들은 테트라사이클린에도 강한 내성을 가졌는데, 이는 테트라사이클린의 사용빈도가 높아(주로 여드름 치료제 등으로 사용한다.) 내성을 가진 균들이 더 많이 있기 때문으로 추정된다.

가) 운동장 개수대(클로람페니콜)

클로람페니콜과 테트라사이클린 모두에서 비교적 낮은 감수성을 가졌다.

나) 운동장 개수대(테트라사이클린)

테트라사이클린에는 내성이 강하나, 클로람페니콜에는 높은 감수성을 가졌다.

다) 화장실 세면대(클로람페니콜)

클로람페니콜과 테트라사이클린 모두에게서 비교적 낮은 감수성을 가졌다.

라) 화장실 세면대(테트라사이클린)

테트라사이클린에는 강한 내성을 가졌으나, 클로람페니콜에는 높은 감수성을 가졌다.

 

다. 기대효과

1) 항생제 내성균이 자주 발견되는 장소와 그 환경적 특성을 통해, 주변 환경에 대한 위생의 질을 높일 수 있을 것이다.

2) 우리 주변에 항생제 내성을 지닌 박테리아가 쉽게 발견될 수 있다는 점을 통해 항생제 오․남용에 따른 박테리아의 항생제 내성에 관한 경각심을 일으킬 수 있을 것이다.

 

라. 제언

1) [연구과제1]에서 TSA/Tetracycline 분리수거장 배지에서 균사가 나온 것으로 보아 접종하는 과정에서의 오염이 있었던 것으로 보인다.

2) [연구과제1]에서 5군데의 균 채취 장소에서 비교적 많은 양의 항생제 내성균이 나온 화장실 세면대와 운동장개수대의 장소의 공통점은 다음과 같다

가) 두 장소 모두 물을 사용하는 곳이므로 항상 습도가 높다.

나) 다른 3곳의 장소보다 사람들의 손이 많이 닿는 장소이다.

3) 이 두 장소의 문제점을 해결 하기위해 우리가 해야 할 일은 다음과 같다.

가) 두 장소 모두 물을 많이 사용하여 습도가 높은 곳이기 때문에 사용 후 수도꼭지를 철저히 막고, 근처에 제습제 등을 놓아 습기를 없앤다.

나) 화장실 세면대는 평소보다 학생들이 더 깨끗이 사용하는 것을 생활화하고 운동장 개수대는 일과가 끝나는 시간에 한 번 씩 청소를 한다.

 

 

 

5. 참고 문헌

[출처] 배지 [ culture medium ] | 네이버 백과사전

[출처] 테트라사이클린 [ tetracycline ] | 네이버 백과사전

[출처] 암피실린 [ Aampicillin ] | 구글 검색

[출처] 클로람페니콜 [ Chloramphenicol ] | 네이버 백과사전

[출처] 항생제 stock solution 제작 비율 | 네이버 지식in